Normalna spermatogeneza u mężczyzny ze zmutowanym hormonem luteinizującym ad 5

Analizę Western blot przeprowadzono na lizacie komórkowym (ścieżki do 3) i pożywce hodowlanej (ścieżki 4 do 6) ludzkich komórek zarodkowych nerek (HEK) 293T: komórki produkujące podjednostkę LH alfa i podjednostkę LH beta typu dzikiego (ścieżki 1). i 4), komórki produkujące podjednostkę LH alfa i zmutowaną podjednostkę LH beta (ścieżki 2 i 5) oraz komórki pozornie transfekowane (ścieżki 3 i 6). Przeciwciało anty-.-aktyna zostało użyte jako kontrola obciążenia (ścieżki do 3). Oddzielono identyczne objętości pożywki hodowlanej, zatężonej przez współczynnik około 20 dla LH beta dzikiego typu (linia 4) i około 400 dla zmutowanej LH beta (linia 5). LH beta dzikiego typu i zmutowaną LH beta poddano immunodetekcji za pomocą przeciwciało przeciw ludzkiej gonadotropinie . (Abcam). Panel B pokazuje niski poziom dimeryzacji podjednostki alfa i zmutowanej podjednostki beta LH. Przeprowadzono eksperymenty koimmunoprecypitacji na lizatach komórkowych z komórek COS-7 wytwarzających konstrukt .-V5 i LH beta typu dzikiego lub zmutowanego. Immunoprecypitację przeprowadzono z użyciem przeciwciała anty-V5 (ścieżki 4 i 5) lub immunoglobuliny nieimmunologicznej jako kontroli (ścieżka 3). Następnie przeprowadzono immunodetekcję LH beta typu dzikiego i zmutowanej LH beta, z zastosowaniem przeciwciała poliklonalnego przeciw ludzkiej gonadotropinie . (Abcam) lub konstruktu .-V5 z przeciwciałem anty-V5. Przeciwciało anty-.-aktyny zastosowano jako kontrolę obciążenia (ścieżki i 2). Panel C wykazuje znacznie niższe poziomy zmutowanej aktywności biologicznej LH w komórkach HEK 293 wyrażających ludzki receptor LH. Wydzielane poziomy LH dzikiego typu zostały określone ilościowo za pomocą testu immunofluorometrycznego i wykorzystane do wygenerowania krzywej dawka-odpowiedź (patrz Fig. Porównawczą ocenę ilościową sekrecji LH beta typu dzikiego i zmutowanej przeprowadzono metodą analizy Western blot (panel A, odzwierciedlający jeden reprezentatywny eksperyment). Komórki HEK 293 eksprymujące ludzki receptor LH stymulowano stężoną pożywką hodowlaną zawierającą podobną ilość LH typu dzikiego lub zmutowaną LH beta. Skoncentrowaną pożywkę hodowlaną z komórek pozornie transfekowanych zastosowano jako kontrolę negatywną. Średnie wyniki są pokazane dla trzech niezależnych eksperymentów wykorzystujących każdą z trzech dawek LH zmutowanego lub dzikiego typu do stymulowania wytwarzania cyklicznego AMP. I słupki wskazują odchylenia standardowe. Zarówno zmutowany jak i dziki hormon luteinizujący beta (oba o wielkości około 15 kDa) 16 zsyntetyzowano w komórkach HEK 293T (Figura 3A). Jednakże zaobserwowaliśmy mniej zmutowanego białka niż białko typu dzikiego w lizatach komórkowych (średni stosunek [. SD] typu dzikiego: mutant, 2,3 . 0,8, z trzech niezależnych eksperymentów), co sugeruje, że delecja może skutkować zmniejszoną stabilnością zmutowane białko lub wpływa na stabilność lub wydajność translacyjną odpowiadającego mu informacyjnego RNA. W stężonej pożywce hodowlanej poziom białka typu dzikiego (wyrażony jako średnia [. SD] trzech niezależnych doświadczeń) był 67,9 . 8,6 razy większy od zmutowanego białka (Figura 3A). Po normalizacji tego stosunku na podstawie stosunku ekspresji wewnątrzkomórkowej obliczyliśmy, że poziom sekrecji (wyrażony jako średnia [. SD] trzech niezależnych eksperymentów) związany z hormonem luteinizującym typu dzikiego wynosił 32,8 . 11,7 (średnia [. SD z trzech niezależnych eksperymentów) razy, które wiązały się ze zmutowanym hormonem luteinizującym beta, gdy były współeksprymowane z podjednostką alfa w komórkach HEK 293T.
Przeprowadzono badania koimmunoprecypitacji z komórkami COS-7 kotransfekowanymi wektorami ekspresyjnymi zawierającymi konstrukt .-V5 i dzikiego typu lub zmutowaną podjednostką beta hormonu luteinizującego w celu określenia, czy defekt sekrecji zmutowanego hormonu luteinizującego beta wynika z defektywnej heterodimeryzacji podjednostki.
[przypisy: nozdrza tylne, ośrodek leczenia uzależnień wrocław, zaburzenia integracji sensorycznej test ]

Powiązane tematy z artykułem: nozdrza tylne ośrodek leczenia uzależnień wrocław zaburzenia integracji sensorycznej test